برای کار کردن اتوکلاو آزمایشگاهی ابتدا آب به دو روش به بخار تبدیل می شود. در روش اول آب به داخل مخزن دستگاه ریخته شده و به وسیله المنتی که اطراف محفظه پیچیده شده است، گرم می شود و تبدیل به بخار خواهد شد. دمای مورد نیاز برای این عمل 100 درجه سانتی گراد می باشد.
در روش دوم آب به مولد بخار وارد شده و پس از تبدیل شدن به بخار شده و وارد محفظه داخلی می شود. روش دوم به دلیل اینکه محل بخار شدن آب جداگانه می باشد، نسبت به مدل اول ارجحیت دارد.
پس از بسته شدن اتوکلاو با شیرهای برقی دما نیز بالا رفته و فشار در داخل اتوکلا شروع به بالا رفتن می کند. پس از رسیدن دما و فشار به مقدار مشخص عملیات استریل سازی شروع خواهد شد.
پس از استریل شدن کامل بخار موجود در محفظه اتوکلاو به کندانسور رفته و با عمل میعان تبدیل به آب شده و به مخزن آب می ریزد. و در آخر عمل خشک کردن انجام شده و وسایل موجود در اتوکلاو خشک می شوند. پس از تمامی این مراحل وسایل برای خارج شدن از دستگاه آماده می شوند.
بر روی تمامی اتوکلاو ها دو دکمه جهت مشخص کردن دما و فشار وجود دارد و تایمر نیز برحسب انتخاب دما و فشار به صورت اتوماتیک مشخص خواهد شد.
هنگام استریل کردن ظروف در آزمایشگاه باید به جنس وسایلی که قرار است در اتوکلاو قرار داده شوند دقت کرد. زیرا برخی ظروف پلاستیکی قابلیت قرار داده شدن در اتوکلاو را ندارند.